血液琼脂培养基的制备

一、实验目的和要求

(1)掌握血液琼脂培养基(血琼脂培养基)的制备方法，明确血液琼脂培养基的用途。

(2)巩固掌握一般培养基和选择性培养基的配制方法和原理。

二、基本原理

血液琼脂培养基可用于分离营养要求高的微生物。一些病原性真菌或放线菌等难养微生物，对营养要求高甚至十分苛刻，而动物血是微生物生长繁殖的优良营养物。研究证明，在45～50℃时加入血液可以保存其中某些不耐热的生长因子，促进微生物生长。血液琼脂培养基也可用于溶血实验。

三、实验材料与设备

(1)培养基：牛肉膏朊胨培养基，见天然培养基——牛肉膏朊胨培养基的制备。

(2)仪器或其他用具：装有5～10粒玻璃珠(Φ≈3mm)的无菌三角烧瓶、无菌注射器、无菌平皿等，其他仪器或用具与天然培养基——牛肉膏朊胨培养基的制备相同。

(3)动物：健康的兔或羊。

四、操作步骤

(1)牛肉膏朊胨培养基的制备见天然培养基——牛肉膏朊胨培养基的制备部分。也可用豆粉琼脂(pH=7．4～7．6)等营养丰富的基础培养基配制血液琼脂培养基。

(2)无菌脱纤维兔血(或羊血)的制备：用配备18号针头的无菌注射器以无菌操作抽取全血(即未经处理的静脉抽血)(无菌采血操作)，并立即注入装有无菌玻璃珠(Φ≈3mm)的无菌三角烧瓶中，然后摇动三角烧瓶1．0min左右，形成的纤维朊块会沉淀在玻璃珠上，把含血细胞和血清的上清液倾人无菌容器即得到脱纤维兔血(或羊血)，置冰箱4℃存储备用。

注意：整个过程必须严格无茵操作。制备脱纤维血液时，应摇动足够时间以防凝固。也可以直接购买脱纤维兔血(或羊血)。

(3)血液琼脂培养基的制备：将牛肉膏朊胨琼脂培养基溶化，待冷却至45～50℃时，以无菌操作方式，按10％(体积分数)的量加入无菌脱纤维兔血(或#血)于培养基中，立即摇荡，以便血液和培养基充分混匀。根据具体情况，还可以考虑是否加入10g／L的葡萄糖。

45～50℃加入血液是为了保存其中某些不耐热的营养物质和保证血细胞的完整，以便于观察细菌的溶血作用；同时，在这种温度下琼脂不会凝固。

(4)迅速以无菌操作倒入无菌平皿中，即成血液琼脂平板，注意不要产生气泡。

(5)置37℃培养箱24h，如无菌生长即可使用。

五、实验报告

(1)消毒、灭菌和除菌有何异同?请列表比较。

(2)高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌和微孔滤膜除菌有何异同?列表比较各自的特点和适用范围。

(3)培养基制备的一般步骤和注意事项是什么?

(4)各种培养基成分的对于微生物生民的主要功能是什么?

(5)各种培养基的适用范围是什么?列表比较牛肉膏朊胨培养基、高氏I号培养基、马丁氏培养基和血液琼脂培养基的成分、特点及应用范围。

(6)为何培养基制作一般选用琼脂作为固定剂而不是其他物质?琼脂是*的固定剂吗?有非琼脂固定培养基吗?

(7)培养基配制过程中，pH如何变化?究竟如何控制和获得适宜的微生物培养pH?pH的调节会影响培养基的物理化学性质吗?

(8)请对照有关国家要求，比如WS 233—2002和GB 19489—2008等，如果开展血液琼脂培养，注意实验室基础条件是否具备?

(9)尽管目前已经有很多培养基的配方，但科学界普遍认为，于实验条件和认知水平所限，人类目前已知的微生物仅占所有微生物的1％，99％左右的微生物尚不为人类所知，请问原因是什么?你能否更新设计一种或多种培养基，来获取和认识更多的微生物?