分享一下关于质粒的分离操作方法

　　今天跟大家分享一下关于 质粒的分离操作方法，下面让我们一起来了解一下吧。

　　从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作

　　材料设备试剂

　　一、材料

　　含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管)，离心管架。

　　二、设备

　　微量取液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

　　三、试剂

　　1、LB液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。

　　2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

　　3、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液:配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

　　4、溶菌酶溶液:用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。

　　5、3mol/lNaAc(pH5.2):50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

　　6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

　　7、溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1%SDS。

　　8、溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L，Acˉ5mol/L。

　　9、RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。

　　10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTris·Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

　　11、氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

　　12、TE缓冲液:10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

　　13、STET:0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。

　　14、STE:0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。

　　15、电泳所用试剂:⑴TBE缓冲液(5×):称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。⑵上样缓冲液(6×):0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。