细胞生长的检查方法（二）

1.检测细胞代谢活性

检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种zui常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1，其还原产物为甲瓒(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)：MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶，甲瓒并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。因此，MTT主要作为终点检测方法。另外，有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95％，的MTT与O₂^-的反应，MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。

(2)二甲氧唑黄比色法(XTT)：XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度，故较MTT法更加快速、简便、敏感。

但XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用。由于XTT的代谢产物呈橘黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。与MTT一样，过氧化物可抑制近95％的XTT与O₂^-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。

(3)内盐法(MTS)：MTS是一种新型的MTT类似物。MTs在偶联剂PMS存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强，同时又克服了MTT、XTT的缺点。

(4)四唑单钠盐法(WST-1)：WST-1是水溶性四唑盐试剂，是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒不是水溶性的，需要由特定的溶解液来溶解：而WST-1和XTT、MTS产生的甲瓒都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

(5)Cell countjn譬kit-8(CCK-8)：CCK-8试剂中含有WST-8。WST-8是近年新开发的一种较WST-1更新的水溶性四唑盐，检测原理与WST-1类似，但较WST-1更稳定，灵敏度更高，溶解性更强，更易于保存。CCK-8检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比MTT、XTT及MTS更高，尤其适合于悬浮细胞，高通量药物筛选。CCK-8法细胞毒性低，细胞检测后还可重复利用，具有更好的实用性，可替代MTT法，具有良好的应用前景。

(6)阿尔玛蓝法：阿尔玛蓝检测试剂为细胞增殖和细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法。阿尔玛蓝在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，可以用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。阿尔玛蓝对细胞无毒、无害，不影响细胞代谢、细胞因子分泌、抗体合成等，可以对同一批细胞的生长状态进行连续观察和进一步的实验。

MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSO中。因此，MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与阿尔玛蓝一样，都是可溶且无毒的。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子。而WST-1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色。阿尔玛蓝的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到。四唑盐和阿尔玛蓝氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。

2.检测ATP含量

ATP是细胞能量的直接来源，细胞内的ATP含量受到严格的调控，死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不舍ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。因此，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。

ATP检测可以用成色反应、荧光、化学发光或同位素等方法实现。目前应用zui广的方法基于萤火虫荧光素酶(催化荧光素氧化，消耗ATP。如果有ATP存在，则荧光素就会发光，发光效率*，发光量与ATP含量呈很好的线性关系，可以反映细胞内ATP的含量。

3.活细胞荧光标记

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群体，各连续代细胞的荧光强度呈对数递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

4.增强标记检测

增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，利用特异性的单抗来识别这些增殖细胞。例如，在人体细胞中，Ki-67，PCNA等可以作为细胞增殖的标志。但是，由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。