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关于小鼠乳腺癌细胞的冻存及复苏操作方法你知道么

更新时间:2023-01-04 点击次数:263
  关于 小鼠乳腺癌细胞的冻存及复苏操作方法你知道么?今天就让我们一起来了解一下吧。
  一、小鼠乳腺癌细胞冻存操作要点:
  1、细胞冻存前12~24h,换新鲜培养基,使细胞一直处于对数生长期。
  2、待细胞长至80%汇合时胰酶消化,用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液,1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。
  3、弃上清,加入冻存液重悬细胞沉淀,调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内,每管1~1.5mL,拧紧盖子。在管壁上做好标记,标明细胞名称、冻存日期等。(细胞冻存液配方可为胎牛血清:培养基:DMSO=4:5:1或胎牛血清:培养基:DMSO=1:8:1或胎牛血清:DMSO=9:1,可根据各实验室实际条件调整)
  4、按下列顺序依次降温:室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便,细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜,再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于低刻度线;冻存5次后异丙醇需要跟换一次,以免影响冻存效果。
  5、细胞冻存后应取出一管复苏,检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存,为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养,观察细胞生长情况,再继续冻存。
  二、小鼠乳腺癌细胞复苏操作要点:
  1、将培养基在37℃水浴锅预热;准备一个15mL无菌的离心管,加入8mL预热培养基。
  2、将冻存细胞从液氮罐中取出,快速放入37℃水浴锅中复温(可准备一洁净的烧杯,装满37℃的水,细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内,再逐步转移到水浴锅中)。轻轻晃动冻存管,使细胞能在1~2min内*解冻,使细胞能尽快通过易受损的温度段(-5~0℃)。注意冻存管管口不能没入水中,避免引起污染。
  3、用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内,将管内细胞转移至准备好的离心管内,轻轻吹打液体,使细胞均匀分散,降低DMSO浓度,吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次,均转移至离心管内。
  4、800rpm离心5min,弃上清,加入新鲜的培养基,吹打制成细胞悬液。
  5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内,补加适量的培养基,轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀,放入温箱内培养。
  6、第二天观察细胞贴壁生长情况,换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养,待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代,细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
  对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心,减少操作步骤,也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内,补加新鲜培养基,放入温箱内培养。但培养12~20h后必须换新鲜的培养基,移除死细胞。
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